192合成儀四個(gè)合成步驟說(shuō)明
更新時(shí)間：2021-12-21 點(diǎn)擊次數(shù)：1204
192合成儀的使用基本采用固相亞磷酰胺三酯法。亞磷酰胺三酯法合成DNA的片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相鄰的核苷酸通過(guò)3'→5'磷酸二酯鍵連接。 192合成儀合成步驟如下：
第一步是將預(yù)先連接在固相載體CPG上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯*酸反應(yīng)，脫去其5'-羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的5'-羥基；
第二步，合成DNA的原料，亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3'端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護(hù)，與溶液中游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。
第三步，帶帽(capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5'-羥基沒(méi)有參加反應(yīng)(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時(shí)分離掉。
第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。
經(jīng)過(guò)以上步驟，一個(gè)脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯*酸脫去它的5'-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過(guò)程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。
192合成儀設(shè)備檢測(cè)引物的純度的方法是：
實(shí)驗(yàn)室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳，一定時(shí)間后(約2-3小時(shí))，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測(cè)帶型，在主帶之下沒(méi)有雜帶，說(shuō)明純度是好的。如果條件許可，也可以用EB 染色或銀染方式染色。
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